一．相關(guān)定義
抗體：機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。免疫球蛋白英文縮寫(xiě)為Ig.
抗原：指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生（特異性）免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)（特異性反應(yīng)）的物質(zhì)。簡(jiǎn)單的說(shuō)抗原就是一種特定的外來(lái)物質(zhì)。
抗原表位：結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定了的抗原決定簇（即能與特異性抗體結(jié)合的區(qū)域）。
抗體的效價(jià)：指抗體的物理狀態(tài)及其在體內(nèi)的滯留時(shí)間，以其與抗原反應(yīng)的多少來(lái)表示其免疫效果。

二．抗原的偶聯(lián)（半抗原的偶聯(lián)）因?yàn)榘肟乖话阒挥蟹磻?yīng)原性，沒(méi)有免疫原性，注入機(jī)體后易被機(jī)體所吸收。一般而言，半抗原連接一定的蛋白載體（BSA, KLH, OVA, HAS等等）就有比較好的免疫原性了，不同的物質(zhì)有不同的偶聯(lián)方法。這個(gè)可以查看相關(guān)資料。

三．動(dòng)物的免疫
1.一般用年輕健康的新西蘭大白兔作為免疫的對(duì)象，大小為4到5斤。
2.兔的免疫劑量為200ug-1mg/次，以后每次適當(dāng)減少，加強(qiáng)免疫的量為首次的1/5-2/5.
3.初次免疫一般將抗原與佛式完全佐劑（由羊毛脂，石蠟油，卡介苗組成，卡介苗起免疫應(yīng)答的作用。）等體積混合，后續(xù)免疫用佛式不完全佐劑等體積混合，一般采取皮下注射免疫周期一般為70天。具體免疫時(shí)間如下：
免疫次數(shù)        免疫時(shí)間    
初次免疫        第1天    
第二次免疫        第20天    
第三次免疫        第40天    
第四次免疫        第60天    

4.最后一次免疫完成10天以后，就可以進(jìn)行終放了。其中在第三次免疫完成以后的第10天即在第50天的時(shí)候靜脈取血檢測(cè)抗體的效價(jià)。
四．抗體效價(jià)的檢測(cè)（一般用ELISA間接法進(jìn)行檢測(cè)）
1）2個(gè)參照:陰性參照為預(yù)取血血清，均以1抗起始濃度稀釋;陽(yáng)性參照為以前陽(yáng)性血清或者細(xì)胞上清
2）于96空板中每孔適量的抗原，邊沿孔應(yīng)盡量避免使用，會(huì)降低細(xì)光值,影響結(jié)果。于4℃過(guò)夜，緊急情況也可以37℃孵育2小時(shí)。
3）倒掉抗原，每孔加入200ul的封閉液，4℃過(guò)夜或者37℃孵育2小時(shí)。
4）倒去封閉液，在吸水紙上拍打盡量吸干殘留液體,用洗滌液洗板三次,每次盡量拍干殘留液體,若要放置一段時(shí)間,盡量風(fēng)干板子,或30℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
5）取包好的96孔板，第一孔加入陰性參照液50ul，第二孔加入陽(yáng)性參照液50ul，第三孔加入稀釋的抗體（1：500=抗體：封閉稀釋液），后面的第四孔到第12孔加入50ul的封閉稀釋液，然后取50ul稀釋的抗體進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?2孔取出50ul的液體，保證每孔液體為50ul。再于37℃孵育1 小時(shí)。
6）倒掉液體，用洗滌液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP標(biāo)記的2抗（1：2000），于37℃孵育45分鐘。
7）倒掉液體，有洗滌液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的TMB底物（A+B等體積配置，現(xiàn)配現(xiàn)用）溫室孵育5—20分鐘(根據(jù)顏色的改變速度)。
8）每孔加入100ul的終止液（0.M草酸），在酶標(biāo)儀上讀取450nm的吸光度。
五．抗體的純化。（一般用親和純化，這種方法得到的抗體的純度高一些。）
(1) 親和柱的制備
1）稱(chēng)取0.3mg溴化QING活化的瓊脂糖凝膠加入1mmol／L的鹽酸中，4`C過(guò)夜使其充分溶漲，可獲得1ml溶漲膠。
2）將凝膠轉(zhuǎn)移入純化柱中，用約30ml 1mmol／L的鹽酸洗介質(zhì)3次。
3）用偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一次，因?yàn)榛罨鶊F(tuán)在偶聯(lián)緩沖液PH值下易水解，所以此步驟最好在幾分鐘內(nèi)完成。
4）將溶解在5ml偶聯(lián)緩沖液中的10-60nmol的配體加入凝膠中，如需測(cè)定結(jié)合效率一定要取少量陪體溶液待測(cè)。
5）溫室下輕輕混合搖動(dòng)2小時(shí)，或4`C過(guò)夜，如需測(cè)定結(jié)合效率此步驟結(jié)束后取少量溶液待測(cè)。
6）用30ml的偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一次。
7）加入15ml阻斷緩沖液溫室孵育2小時(shí)或4`C過(guò)夜。
8）依次用20ml的偶聯(lián)緩沖液和20ml的乙酸鹽緩沖液洗介質(zhì)一次。重復(fù)4次步驟8。
9）重復(fù)4次步驟8。
10）配體固相化完成，可用于純化。
11）若不立即使用，用20%的乙醇封存。
（2）抗體的純化
1）原血清用PBS等體積稀釋?zhuān)靹?min，5000-10000r／min，4-20離心15分鐘，取上清，并留樣送檢。
2）用層析儀或手工，10倍體積的PBS 2-4ml／min流速清洗平衡柱子。
3）稀釋離心完的上清樣品，0.5-1ml／min流速上樣。
4）上樣完后，用15倍體積的PBS2-4ml／min流速清洗平衡柱子，洗去柱子上殘留的雜蛋白。
5）用5-10倍體積的Anitibody Elute Buffer C 洗脫結(jié)合在親和柱子上的抗體，分管收集，沒(méi)管收集1ml并預(yù)先滴加100ul Anitibody Elurte Buffer D調(diào)PH至中性（PH7-7.5），如果有層析儀也可以根據(jù)層析儀紫外吸收峰檢測(cè)收集。
6）洗脫完畢后，柱子用5倍體積的PBS 2-4mi／min流速清洗平衡。
7）用20%的酒精封存柱子，4`C保存。
（3）抗體的濃縮
1）一般收集濃度較高的幾管洗脫液，無(wú)須濃縮，若弄多實(shí)在太低（小于0.5mg／ml），則將收集的餾分加和起來(lái)。
2）轉(zhuǎn)移入15ml 的超濾管，3500r／min離心20分鐘左右（根據(jù)要濃縮的體積摸索離心時(shí)間），將濃縮好的抗體小心的用移液器取出來(lái)。
3）取700ul 濃縮的抗體檢測(cè)280nm的吸光度，讀數(shù)不要超過(guò)2，用吸光度讀數(shù)除以1.35，即為抗體的大致濃度?？贵w的濃度也可以用（OD280nm-0.35xOD495nm）1.4這個(gè)公式計(jì)算。濃縮的程度：使抗體的濃度在0.5-1mg／ml之間最好。最后通過(guò)濃度x體積計(jì)算抗體的總量。
（4）抗體的保存
抗體中添加40-50%甘油，可以短時(shí)間存放于4℃，如需以后使用，一般500ul／管凍存于-20℃或者更低溫度的冰箱中。
（5)抗體純度的鑒定
一般而言，我們?cè)趯⒖贵w純化以后，如果想知道抗體的純度和濃度究竟怎么樣，就需要走個(gè)SDS-PAGE電泳。電泳的方法在網(wǎng)上到處都是，在此就不多說(shuō)了。